Получение рекомбинантных молекул ДНК включает объединение in vitro сегментов ДНК из различных источников. Благодаря тому, что при расщеплении ДНК определенными эндонуклеазами образуются фрагменты с липкими концами, при отжиге эти фрагменты довольно легко соединяются, однако водородные связи, удерживающие их вместе, в обычных условиях оказываются относительно слабыми и легко разрушаются. Для ковалентного сшивания фрагментов используют ДНК-лигазу, которая катализирует образование фосфодиэфирных связей между соседними нуклеотидами. TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
Чтобы лигирование было успешным, в объединяемых цепях должен произойти отжиг комплементарных концов; в этом случае происходит лигирование обеих цепей. Если два одноцепочечных сегмента удерживаются рядом за счет образования водородных связей с интактной комплементарной цепью, то образование фосфодиэфирной связи происходит только в одной цепи. ДНК-лигаза фага Т4 способна также соединить двухцепочечные молекулы с тупыми концами, катализируя образование фосфо-диэфирных связей в обеих цепях.
Цепи удлиняются путем последовательного присоединения нуклеотидов к праймеру со свободной 3'-гид-роксильной группой; выбор нуклеотидного остатка на каждом этапе определяется ДНК-матрицей. ДНК-полимераза I E. coli катализирует и некоторые другие важные реакции. Две из них имеют особое значение для экспериментов с рекомбинантными ДНК: это 3'–>5'- и 5'–>3'-экзонуклеазные реакции. В обоих случаях образуются продукты с 5'-фосфомоноэфирными концами. Две указанные экзонуклеазные активности присущи разным участкам молекулы ДНК-полимеразы I, которые можно разделить, обработав белок протеолитическими ферментами. После разделения обнаруживается, что 3'–>5'-экзонуклеазная и полимеразная активности связаны с большим по размеру полипептидом, содержащим карбоксильную группу на конце, а 5'–>3'-экзонуклеазная активность – со вторым, более мелким фрагментом.
б. Никтрансляция
Реакции, катализируемые ДНК-полимеразой I, нашли широкое применение. Например, часто используется способность ДНК-полимеразы I катализировать одновременно как полимеризацию, так и 5'–>3'-экзонуклеазное расщепление. Фермент, выступая в роли экзонуклеазы, осуществляет деградацию цепи в 5'–>3'-направлении, начиная с 5'-конца одноцепочечной бреши в двухцепочечной ДНК, а выступая в роли полимеразы, восстанавливает цепь путем последовательного присоединения мононуклеотидных остатков к свободной 3'-гидроксильной группе на другом конце бреши. Собственно синтеза ДНК не происходит: брешь лишь перемещается вдоль цепи, чем и объясняется название этого процесса – никтрансляция. Проводя никтрансляцию в присутствии а-32Р-меченных дезоксинуклеозидтрифосфатов, в качестве субстратов получают меченые фрагменты ДНК с высокой удельной активностью.
в. Заполнение брешей
ДНК-полимераза способна превращать фрагменты ДНК с липкими концами во фрагменты с тупыми концами при наличии выступающего 5'-конца. 3'-гидроксильный конец служит праймером, 5'-выступ – матрицей; пробел на 3'-конце заполняется путем последовательного присоединения дезоксинуклеотидных остатков. Для заполнения лучше использовать большой карбоксиконцевой фрагмент ДНК-полимеразы I, получаемый в результате протеолиза; это позволяет избежать 5'–>3'-экзонуклеазного расщепления матрицы. Липкие концы можно превратить в тупые и с помощью специфичной к одноцепочечной ДНК нуклеазы, однако в этом случае утрачивается несколько нуклеотидных остатков.
Статьи и публикации:
Компоненты боли
В отличие от других видов ощущения, боль – это нечто большее, чем простое ощущение, она имеет многокомпонентный характер. В разных ситуациях компоненты боли могут иметь неодинаковую выраженность.
Сенсорный компонент боли характеризует её ...
Изменение мышц под влияние физической нагрузки
Физические нагрузки при трудовых процессах, естественных движениях человека, занятиях спортом оказывают влияние на все системы организма, в том числе и на мышцы, изменяя их строение и функцию. Однако в различных видах спорта нагрузка на м ...
Органы дыхания
Дыхание – это совокупность процессов, обеспечивающих поступление в организм кислорода и удаление углекислого газа (внешнее дыхание), а также использование кислорода клетками и тканями для окисления органических веществ с освобождением эне ...