Каталитическая активность мембранных ферментов часто очень сильно зависит от используемого детергента или фосфолипида. Обычно активность мембранных ферментов измеряют в смеси, содержащей детергент и экзогенно добавленный фосфолипид. Кроме того, ферментный препарат нередко содержит соочищаемые с ним эндогенные липиды. В таких условиях физическое состояние фермента, в частности степень его агрегации, оказывается весьма неопределённым и скорее всего гетерогенным. Часто в одной и той же среде, компоненты которой смешивались в разной последовательности, получают совершенно разные ферментативные активности. Такая зависимость от предыстории препарата являет собой пример гистерезиса и весьма типична для мембранных ферментов. По существу фермент «застревает» в метастабильном состоянии и не может приобрести наиболее стабильную «рабочую конформацию». TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
После того как мембранный фермент очищен, для изучения его каталитической активности желательно, а часто и необходимо реконструировать его с фосфолипидами. Изучение очищенных и реконструированных ферментов даёт большие преимущества. В частности, в такой системе не протекают различные конкурирующие реакции, присущие биомембранам. Использование реконструированной системы позволяет не только охарактеризовать изолированную систему, но и определить минимальное число компонентов, необходимых для проявления тех или иных биохимических активностей.
Для встраивания мембранного белка в липидную везикулу, прежде всего, необходимо избавиться от находящегося в препарате белка детергента, который, если он присутствует в значительных количествах, дестабилизирует фосфолипидный бислой. Обычно детергент удаляют уже из смеси белка с фосфолипидом, но в некоторых случаях белок очищают от детергента до начала реконструкции. Для удаления детергента используют гель-фильтрацию, диализ или адсорбцию на поверхности шариков из полистирола. Последний способ применяют в первую очередь для удаления тритона Х-100.
Методы реконструкции можно разделить на две группы.
1. Процедуры, при которых белок предварительно очищают от детергента, а затем проводят реконструкцию.
2. Процедуры, в которых белки и фосфолипиды смешивают в присутствии детергента, а затем удаляют детергент до образования протеолипосом. Выбранный фосфолипид должен быть способен к формированию стабильных бислоев.
Реконструкция без избытка детергента
1. Инкубация белка с заранее полученными везикулами.
Этот способ используется для реконструкции не пронизывающих бислой белков с ограниченной гидрофобной поверхностью, например цитохрома b5 и в-гидроксибутиратдегидрогеназы.
2. Реконструкция с участием амфифильных катализаторов.
Добавление в белково-фосфолипидную смесь амфифильных веществ в низких концентрациях облегчает встраивание в везикулы таких мембранных ферментов, как бактериородопсин или цитохром с-оксидаза. В качестве амфифильных веществ использовали холестерол, короткоцепочесные фосфатидилхолины и жирные кислоты. Данный способ хорош тем, что в нём не используют какие-либо грубые процедуры, в том числе обработка избытком детергентов, однако пока он мало распространён.
3. Замораживание – оттаивание/обработка ультразвуком.
Эта методика, однако, применяется нечасто из-за опасности денатурации белка. Иногда для облегчения реконструкции используют простую обработку ультразвуком. Вероятнее всего, белок вначале включается в маленькие везикулы, обладающие высокой кривизной. Замораживание – оттаивание, возможно, нужно для слияния мелких протеолипосом в более однородные по размерам.
Реконструкция с использованием детергентов
Статьи и публикации:
Структурные элементы нервной клетки
Различные структурные элементы нейрона имеют свои функциональные особенности и разное физиологическое значение. Нервная клетка состоит из тела, или сомы, и различных отростков. Многочисленные древовидно разветвлённые отростки дендриты слу ...
Сложность физиологических процессов
Такие физиологические процессы, как фотосинтез, дыхание или транспирация представляют совокупность химических и физических процессов. Чтобы понять механизм физиологического процесса, необходимо выделить его физические и химические компоне ...
Солнечная система, происхождение и строение планет
Солнечная система состоит из 9 планет и звезды Солнца, а также спутников планет, астероидов и комет.
Планеты расположены по следующей схеме: Меркурий, Венера, Земля, Марс, Юпитер, Сатурн, Уран, Нептун, Плутон.
Исходя из современной теор ...