Ретинальсодержащий белок (хромофор - протонированный альдемин ретиналя с e-аминогруппой Lys-216) - бактериородопсин (БR) выполняет функции АТФ-зависимой транслоказы в клеточной мембране галофильных бактерий Halobacterium halobium [1]. Несмотря на его структурно-функциональную изученность, он остается в центре внимания биотехнологии из-за своей высокой светочувствительности и разрешающей способности и используется в прикладных целях как биологический фотохромный материал [2]. БR также привлекателен, как модельный объект для изучения функциональной активности и структурных свойств мембранных белков в составе искусственно сконструированных энергопреобразующих мембран [3]. TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
Для целого ряда структурно-функциональных исследований с БР целесообразно вводить в молекулу белка изотопную метку дейтерия, позволяющую использовать для последующего анализа изотопного включения метод высокочувствительной масс-спектрометрии электронного удара [4, 5]. Поэтому большое научно-прикладное значение имеет БR, меченный дейтерием по остаткам функционально важных ароматических аминокислот - фенилаланина, тирозина и триптофана, участвующих в гидрофобном взаимодействии полипептидной цепи белка с липидным бислоем клеточной мембраны [6]. 2Н-меченые ароматические аминокислоты могут быть синтезированы с препаративными выходами методом обратного изотопного обмена (1Н-2Н) в молекулах протонированных аминокислот - [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланин в 85% 2H2SO4 при 500C, [3, 5-2H2]тирозин в 6 н. 2H2SO4 при слабом кипячении реакционной смеси, [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофан в 75% 2H-меченой трифторуксусной кислоте при 250С [7, 8]. Однако несмотря на изученность современных методов химического синтеза 2Н-меченых ароматических аминокислот, отечественная индустрия индивидуальных 2Н-меченых мембранных белков не получила необходимого развития.
В настоящей работе осуществлен биосинтез БР, меченного дейтерием по остаткам [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланина, [3, 5-2H2]тирозина и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана для реконструкции искусственных мембран с последующим микропрепаративным выделением, а также исследован уровень дейтерированности молекулы БР методом масс-спектрометрии электронного удара метиловых эфиров N-диметиламинонафталин-5-сульфонильных (Днс)-производных аминокислот с обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Выбор стратегии биосинтеза 2Н-меченого БР c использованием штамма экстремальной галофильной бактерии Halobacterium halobium определялся целью исследования, связанной с изучением принципиальной возможности получения 2Н-меченых препаратов мембранного белка в микропрепаративном количестве для реконструкции искусственных мембран. При выборе [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланина, [3, 5-2H2]тирозина и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофана в качестве источников дейтерия учитывалась их исключительная важность в гидрофобном взаимодействии молекулы БР с лилипидным бислоем клеточной мембраны, устойчивость к реакциям (1H-2H) обмена в водной среде в условиях выращивания штамма-продуцента, а также возможность применения метода высокочувствительной масс-спектрометрии электронного удара для последующего анализа. В оптимальных условиях выращивания штамма H halobium (синтетическая среда с 4.3 М NaCl, период инкубации 3-4 сут, 35-370С при освещении монохромным светом с 560 нм) в клетке синтезировался каротиноидсодержащий фиолетовый пигмент, по спектральному соотношению белкового и хромофорного фрагментов молекулы D280/D568 1.5:1 идентичный нативному БР. Как показали результаты исследования, рост штамма на синтетической среде (рис. 1, б) ингибировался незначительно по сравнению с контролем (а) на протонированной среде, что существенно упрощает оптимизацию условий биосинтеза 2Н-меченого БР, заключающуюся в эквивалентной замене протонированных ароматических аминокислот среды их дейтерированными аналогами - [2, 3, 4, 5, 6-2Н5]фенилаланином (0.26 г/л), [3, 5-2H2]тирозином (0.2 г/л) и [2, 4, 5, 6, 7-2H5]триптофаном (0.5 г/л).
Статьи и публикации:
Семейство Athyriaceae - Кочедыжниковые
Многолетнее растение до 100 см высотой. Листья крупные, дважды или почти триджы перисторассечённые, со сравнительно короткими черешками, покрытыми буроватыми чешуйками. Сорусы серповидные, реже овальные, плотно расположенные; покрывальце ...
Секвенирование ДНК
Для определения нуклеотидной последовательности в ДНК были разработаны два метода:
1. Метод с использованием "минус- и плюс"-систем ("минус-плюс"-метод, метод Сенгера).
2. Метод с использованием диметилсульфата и гид ...
Биогенный стресс и катаболизм
В предыдущем разделе уже затрагивался вопрос о влиянии патогенов на образование углеводных элиситоров и белковый обмен. В последние годы появляется все больше информации о метаболическом взаимодействии патогенных организмов - бактерий и г ...