В основе точной идентификации белковой молекулы лежит определение аминокислотной последовательности. Уже на первом этапе этого процесса, включающего расщепление белка на мелкие фрагменты, можно получить значительную информацию о данном белке. Так, фермент трипсин отщепляет остатки лизина и аргинина со стороны карбоксильных групп; химический реактив бромистый циан расщепляет пептидные связи, расположенные после остатков метионина. Поскольку такие специфические ферменты и реактивы расщепляют в белковой молекуле ограниченное количество связей, при их воздействии образуется смесь больших пептидов. Разделив эту смесь методом электрофореза или хроматографии, можно получить пептидную карту, TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT
характеризующую исследуемый белок. Такие пептидные карты называют иногда "фингерпринтами" (отпечатками пальцев) белка.
После разделения пептидов определяют последовательность аминокислот в каждом из выделенных пептидных фрагментов. Сперва пептид обрабатывают каким-либо реактивом, взаимодействующим только со свободной аминогруппой на его N-конце, специфически расщепляют пептидную связь. Высвобождающуюся аминокислоту идентифицируют методом хроматографии. Оставшийся пептид укорачивается на одну аминокислоту. Его также подвергают реакциям, проводимым в той же последовательности. Циклический характер этих реакций дал возможность автоматизировать весь процесс в приборах секвенаторах. На последнем этапе анализа последовательности аминокислот, полученные для пептидных фрагментов, располагают в том же порядке, как они были расположены в интактной цепи. Для этого сравнивают последовательности наборов перекрывающихся фрагментов, полученных при расщеплении одного и того же белка различными протеолитическими ферментами.
В настоящее время достаточно определить в белке 20 аминокислот, чтобы сконструировать ДНК-зонд, используемый для клонирования соответствующего гена. После выделения гена оставшаяся невыясненной часть аминокислотной последовательности белка может быть реконструирована по нуклеотидной последовательности согласно генетическому коду.
Рассмотрим два метода определения молекул внутри клеток: один из них включает использование радиоактивных изотопов, а другой - использование антител. Оба метода весьма эффективны для выявления определенных молекул в сложных смесях. Потенциально эти методы очень чувствительны и при оптимальных условиях дают возможность обнаруживать в образце молекулы, общее количество которых меньше 1000.
Радиоактивные молекулы можно использовать для исследования практически всех внутриклеточных процессов. Для этого обычно в ходе эксперимента в культуральную среду добавляют предшественник в радиоактивной форме: при этом радиоактивные молекулы смешиваются с присутствующими в клетках нерадиоактивными. Клетка использует оба типа молекул, поскольку они отличаются только массой атомного ядра. Изменение локализации радиоактивных молекул в клетке или их химические превращения можно проследить во времени. Именно этот метод дает возможность дискриминировать химически идентичные молекулы, история которых различна - например, те молекулы, которые отличаются временем синтеза. С помощью радиоактивных методов удалось определить, что почти все молекулы живой клетки постоянно разрушаются и замещаются другими молекулами.
Одна из наиболее важных областей применения радиоактивных изотопов в биологии клетки - это определение локализации радиоактивных соединений в срезах клеток или живых тканей методом радиоавтографии. При использовании этого метода живые клетки подвергаются кратковременному мечению с последующей инкубацией в течении различных промежутков времени в нерадиоактивной среде. Затем клетки фиксируют и обрабатывают для проведения световой или электронной микроскопии. Каждый приготовленный препарат покрывают тонким слоем фотоэмульсии и оставляют на несколько дней в темноте - время, в течении, которого происходит распад радиоактивного изотопа. Затем фотоэмульсию проявляют. Месторасположение радиоактивных молекул в каждой клетке можно определить по расположению темных зерен серебра.
Антителами называют белки, продуцируемые позвоночными животными для защиты от инфекции. Каждая форма антител обладает определенными участками связывания, которые предназначены для специфического узнавания молекул, стимулировавших синтез антител. Эти молекулы называют антигенами. Высокая специфичность антител в отношении антигена превращает их в мощный инструмент для исследования биологии клетки. После окрашивания антител флуоресцирующими красителями их можно использовать для определения внутриклеточной локализации специфических макромолекул с помощью флуоресцентной микроскопии. Мечение электроноплотными микрочастицами, например микросферами коллоидного золота, позволяет использовать антитела для локализации клеточных антигенов при помощи электронной микроскопии. Антитела могут выступать в роли биохимических звеньев для выявления и определения количества молекул в клеточных экстрактах и идентификации специфических белков после их разделения с помощью электрофореза в полиакриламидном геле. При связывании антител с инертным матриксом получают аффинные колонки, пригодные для выделения и очистки специфических молекул из грубых клеточных экстрактов.
Статьи и публикации:
Традиционные методы получения
и очистки биополимеров
Технологии получения биополимеров клетки включают следующие направления:
биопроцессинг с использованием живых клеток как продуцентов биополимеров - нуклеиновых кислот, белков, гормонов, стероидов, углеводов, полисахаридов, моно - и полик ...
Физиологическое состояние
Все особи в улове были здоровыми, без видимых признаков каких-либо заболеваний. Паразитов на внешних или на внутренних покровах тела не обнаружено. Тела всех особей плотные, эластичные. Чешуйный покров целый, чешуя блестящая, с перламутро ...
Электронная микроскопия
Просвечивающая электронная микроскопия тонких срезов миелина, а фактически и всех остальных мембран, выявляет характерную трехслойную структуру, состоящую из двух электроноплотных полос, разделенных промежутком около 80 А. Такая картина п ...